低丰度脂质分离富集技术研发历程回顾
王紫丹 博士
瑕瑜课题组
感谢贺思敏老师的邀请和瑕瑜老师的推荐，让我有机会回顾这段充满挑战与惊喜的博士生涯。
我本科就读于安徽大学应用化学专业。2017年，我怀揣着对科研的热忱，踏入复旦大学，师从邓春晖教授，基于功能性磁性纳米材料的设计，开发翻译后修饰蛋白组学样本前处理方法。这段经历不仅锻炼了我的实验技能，也为我日后的研究埋下了伏笔。2019年夏天，在邓老师的引荐下，我在上海与瑕瑜老师初次见面。瑕瑜老师在脂质组学领域深耕多年，开发了基于Paternò-Büchi（PB）反应的脂质光化学衍生化方法，将脂质组学研究推向了精细结构层次。
糖脂篇
彼时，翻译后修饰蛋白的样本前处理研究已经发展了多种较为成熟的方法。多功能的磁性纳米材料凭借其高比表面积、优秀的磁响应性以及多样化的表面修饰，在众多样本前处理方法中脱颖而出。经典的唾液酸糖-金属离子配位化学、磷酸-金属离子配位化学，以及基于糖链亲水性开发的亲水相互作用，都极大地推动了糖蛋白和磷酸化蛋白组学的发展。然而，糖链修饰不仅存在于蛋白质上，脂质作为一种糖链载体，其丰度低于全脂质组的5%。此外，糖脂（本文指中性鞘糖脂）受到高丰度磷脂的干扰，使其难以在常规的脂质组学分析流程中实现(链组成水平~70种，C=C水平<30种)鉴定。因此，开发用于糖脂的分离富集样本前处理方法成为研究的关键。
在与瑕瑜老师深入讨论后，我们带着明确的目标，在2021年3月正式启动了这一课题。此前已有研究表明，二氧化钛的Ti(IV)对糖的多羟基结构具有配位识别能力，其碱性条件富集（排除磷酸配位吸附）、酸性条件洗脱（释放糖脂）的机制非常清晰。然而，仅调节pH条件无法分离糖脂和磷脂。考虑到磷脂仍然会与Ti(IV)存在广泛的静电相互作用，我提出采用高浓度阳离子去破坏静电吸附，通过加入铵盐，形成NH4+正电荷层，去除磷脂。同时，多次加入新鲜的NH4+缓冲液进行磷脂的洗涤，可以重复破坏其静电吸附平衡，实现高达99.9%磷脂的去除，且不干扰糖脂的稳定配位。这大大提高了该方法对不同生物样本的适用性，满足了糖脂丰度在0.03%（血浆）～3%（脑组织）的样本的处理。针对寡糖（3-4糖）修饰糖脂捕获后难以释放的现象，我提出使用具有相似结构的葡萄糖竞争吸附剂，竞争寡糖的配位位点，成功将其回收率提高至80%。
低丰度糖脂分离富集示意图
如我们预想的，分离富集有效的提升了质谱鉴定对糖脂的覆盖度。在猪脑和血浆中，我们均鉴定到高达300种鞘糖脂，丰度跨越4个数量级（RPLC-MS/MS）。进一步结合PB衍生化（PB-RPLC-MS/MS），我们揭示了200余种双键水平和羟基修饰位置水平的糖脂分子种类。目前LIPID MAPS中收录了包括实验测得 (LC-MS, 70余种) 及推测得到的300余种1-4糖的中性鞘糖脂种类，我们的方法有效填补了中性鞘糖脂结构数据库的空白领域。
糖脂作为髓鞘结构的重要组成部分，能够有效保护神经电信号的快速传导。为了进一步探索糖脂在病理学中的作用，我们与清华大学精密仪器系的张文鹏老师和中山医院的花玮医生开展了合作，对人脑胶质瘤组织的糖脂组进行了解析。通过在糖脂的多层级结构上进行相对定量分析，我们灵敏地观察到胶质瘤组织中鞘糖脂多个结构层级的微小丰度变化。基于糖脂特征结构的变化，我们实现了异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变型胶质瘤、IDH野生型胶质瘤以及正常组织的区分。其中，我们观察到的糖脂结构图谱的改变对缺乏分子分型标志物的IDH野生型胶质瘤具有重要意义。此外，根据已知的70余种糖脂合成酶的功能，脂质数据体现的特征结构变化准确的追溯到了其中两类酶在胶质瘤组织中的异常水平。以下游代谢组学为探测器，识别其相关酶的水平异常，或为今后多组学研究提供新的思路。
经过半年的数据处理，2023年3月，我正式进入写作阶段。我们投稿到《Nature Communications》，其中两位审稿人评价较好，仅建议更改部分表述，而第三位审稿人对纳米材料的表征和富集机制提出了疑问。我补充了实验，这些数据使整篇文章更加完整，半年之后，文章被顺利接收，被顺利接收 ([1] Wang Z, Zhang D, Wu J, Zhang W, Xia Y. Illuminating the dark space of neutral glycosphingolipidome by selective enrichment and profiling at multi-structural levels. Nat Commun, 2024, 15:5627)。2024年7月，我们将血浆中循环鞘糖脂的样本处理方法投稿至《Analytical Chemistry》，并在一轮审稿意见回复后顺利接收 ([2] Wang Z, Xia Y. Selective Enrichment via TiO2 Magnetic Nanoparticles Enables Deep Profiling of Circulating Neutral Glycosphingolipids. Anal Chem. 2024. 96(42):16955-16963.)。
磷酸磷脂酰肌醇篇
除糖脂外，脂质组中还有一类重要的“明星信号分子”——磷酸磷脂酰肌醇（PIPn）。PIPn在细胞中的丰度极低，仅为脂质组的0.5%，但其在细胞信号传导和生理活动中扮演着不可或缺的角色。近年来，PIPn相关的信号通路和细胞生理活动逐渐被揭示，但基于质谱的分子结构解析仍受限于其低丰度，仅十余种脂链组成结构得到鉴定。PIPn的多磷酸结构极易在金属器皿的表面吸附，从而造成损失。尽管将细胞冷冻在-80℃，长时间的存放也出现了PIPn降解。在无法保证实验重复性的前提下，进行步骤优化变得异常困难。在此，我们开创了基于TiO2的PIPn“一管法”样本前处理，通过将样本前处理步骤集成在一个离心管中进行，有效降低了PIPn的损失，并大大提高了实验重复性。该方法成功实现了7类PIPn亚类的高回收率（>80%）和高选择性（去除99.9%磷脂）富集，解析了100余种链组成水平的PIPn，以及70余种PIPn的双键。
在方法搭建完成后，我们与清华大学尹航教授课题组的靳学博士和闫帅廷同学展开了合作。我们共同开展了免疫刺激下RAW细胞中PIPn的代谢图谱解析，并发现显著的PIPn脂链结构重整现象。这一现象提示我们，信号脂质的脂链结构调节或在细胞生理过程中发挥着意想不到的作用。目前，该文已在撰写投稿过程中。
交流篇
除了实验室的科研生活外，我非常荣幸的在学校与瑕老师的资助下参加了多次学术会议。我在2023年ASMS（美国质谱学会年会）和2024年ASMS上分别以海报形式交流了糖脂和PIPn的研究成果。2024年，我的PIPn研究在ILS（国际脂质科学大会）会议上进行了展示，并荣幸地获得了最佳海报奖。每次介绍工作时，都是一次思路上的整理，并且有效的锻炼了我的交流能力。在会议中，我可以观摩到多个领域的工作，与作者进行交流，这极大的拓宽了我的视野。
2023ASMS海报交流；(b) Xia lab 成员在2024 ASMS；(c) 2024 ILS (d) ILS会议海报交流现场；(e) 最佳海报奖颁奖现场 (瑕瑜老师与颜宁老师为大家颁奖)
毕业篇
博士期间工作梗概
在完成了糖脂的两篇文章和PIPn的方法搭建及数据收集后，我于2024年11月顺利完成了博士学位论文答辩。目前，我在瑕瑜教授课题组担任科研助理，以收尾PIPn的工作。
未来篇
如今，我在积极准备博士后岗位的申请，希望在进一步发展有效的脂质分析工具，并拓宽现有工具的应用。
脂质作为一种下游的代谢组小分子，其结构受酶调节，脂链结构往往出现特征性的集体变化。本文中，糖脂多层级结构的解析结合已知的酶功能库的分析，快速追溯到特定脂质-特定酶/mRNA的一致调节，并为胶质瘤组织脂质图谱变化提供了解释。但后续，我们仍需回答，特定链长、特定羟基修饰的脂质如何服务组织的病变。此后，基于生物物理特性、信号传导机制等方面，建立脂质精细结构与组织病变的关系，或将为脂质类疾病标志物带来更有信心的应用。
抛开疾病的研究，当这数百种低丰度脂质分子以低丰度的水平存在于我们的细胞、体液中，它们究竟在发挥什么样的功能？这些分子水平的微小结构差异究竟有何意义？例如碳链的碳数差异，双键位置的差异。在我们的研究中，一个引人注目的发现是糖脂在脑组织和血浆中的结构分布存在显著差异。这些糖脂分子是如何在人体不同部位形成差异性分布的？这样的分布状态又服务了怎样的生理功能？面对低丰度脂质研究中的诸多未解之谜，我们深知，单靠现有的分析手段是远远不够的。未来的探索需要跨领域的科研人员携手合作，共同构建一个完整的低丰度脂质结构-功能-潜在应用的研究体系。
此外，脂质的细胞生物学研究也在逐渐铺展，监测信号脂质的代谢，发掘信号脂质功能，将助力于小分子药物的研究。
感悟篇
以上通篇学术报告氛围过浓，我还是想在结尾总结一些经验，希望能帮助在前行路上的朋友。
在我的实验中，最多困扰我的问题就是实验的重复性。在面临多次实验无法重复的困境时，我开始把所有实验细节、实验现象尽可能详细的记录。此外，我会时不时翻看之前得到的数据，并在积累一段时间文献和实验经验后，再次评估当时的数据，可能会有新的结论。当实验遇到问题，我就会和同窗聊聊，去查阅文献，丰富知识，专注于解决问题，而不要怀疑自己。
再次，衷心感谢所有合作者、Xia lab的同窗，以及瑕瑜教授。
参考文献：
[1] Wang Z, Zhang D, Wu J, Zhang W, Xia Y. Illuminating the dark space of neutral glycosphingolipidome by selective enrichment and profiling at multi-structural levels. Nat Commun, 2024, 15:5627.
[2] Wang Z, Xia Y. Selective Enrichment via TiO2 Magnetic Nanoparticles Enables Deep Profiling of Circulating Neutral Glycosphingolipids. Anal Chem. 2024. 96(42):16955-16963.
