瑕瑜课题组 | 施恒学的博士生涯
大家好，我是清华大学化学系瑕瑜课题组 2019 级博士生施恒学，于2025年6月获得博士学位。应瑕老师要求，回首博士生涯，很荣幸与大家分享我的成长点滴。
我本科就读兰州大学化学专业，当时对科研并无清晰认知，也难以确定自己是否怀有科研热忱。2018年，抱着对质谱分析方向的初步认知和兴趣，我通过夏令营申请进入了瑕瑜老师课题组，2019年7月带着对未来的期待与忐忑来到北京，开启了博士生涯。来到北京后，我深入了解了瑕老师课题组的科研方向和成果，才发现课题组长期专注于脂质精细结构分析方法的发展。其中，小组开发的Paternò Büchi反应-串联质谱（PB - MS/MS）用于解析脂质C=C位置，以及自由基诱导解离（RDD）等研究工作，在方法学上独具创新性，为脂质研究领域提供了全新视角与技术手段。
Part1 茫然起步
按照小组惯例，我先跟着高我一个年级的师兄夏天学习质谱、色谱和基本实验操作。在师兄的悉心指导下，我逐渐了解了仪器参数的含义以及如何解决仪器的问题。幸运的是，当时我们小组与精仪系其他老师的同学共用一个大办公室，这让我能时常向仪器背景的同学请教问题，解决了不少实验中的困惑。
那个学期，我接手了第一个小课题——使用吡啶硼酸试剂衍生sphingosine的1,3-diol 结构。虽然初步优化衍生化条件取得了一些正面效果，比如抑制脂质正模式的失水峰和提高离子化效率，但由于当时对实验设计缺乏经验，实验过程较为混乱，走了不少弯路，2020年的寒假便在焦虑中度过。直到2020年8月才得以返校。在家里的这段时间，并未阻碍我和瑕老师的交流，我们通过线上组会读了大量文献，共同探讨了光催化PB反应、氮杂PB、光产生自由基RDD等课题方向。我还记得，在江南梅雨季时，外面下着雨，戴着耳机的我开着组会，直到父亲来电提醒我收衣服和天台晾着的梅干菜，我才顶着风雨爬上天台，一边收拾梅干菜一边听组会，现在想来颇觉有趣。
那段时间，PB-MS/MS 的进一步发展受到脂质 PB 反应产率普遍偏低的限制。我们注意到Yoon课题组和Schindler课题组在Organic Letters上背靠背发表 2 篇文章（Org. Lett. 2020, 22, 6520；Org. Lett. 2020, 22, 6516.），报道了使用 Ir(III) 配合物作为催化剂实现可见光条件下大于90%的PB反应产率。受此启发，我们萌生了将光催化反应应用于脂质分析的想法，于是我开始着手调研。8月底回到北京后，我与此前已取得初步数据的任翰林同学推进这一课题。初步实验显示，该反应可用于脂质分析，PB 产物的 MS2 CID 能提供C=C位置信息，但产率远低于预期，仅 1% 左右，甚至低于 UV PB 反应，主要原因是严重的氧化产物。
为解决这一问题，我们尝试了两种思路：一是更换 PB 试剂或光催化剂，二是抑制氧化产物。在更换试剂方面，我们尝试了十种左右PB 试剂和十种左右的理论上性能更佳的光催化剂，其中三个PB试剂需自行合成，历经多条合成路径才获得足够能与脂质反应的 PB 试剂，但质谱检测不到对应的PB产物，这不免让人沮丧。光催化剂方面，我们也是注意到兰州大学刘强教授课题组发表的对于光催化剂的筛选实现了高的能量转移过程（ACS Catal. 2021, 11, 1, 446.），但是这些都没有带来好的实验效果。在改变光反应装置方面，我们尝试了激光器作为光源、使用石英皿、slug-flow、石英毛细管等五种以上装置，并将反应装置送入手套箱，经过一番努力，PB 产率提升至 30-40%，虽未达有机反应的90 %水平，但已算小有进步。同时，我们还设计了针对电离效率低的脂质的电荷标签光催化 PB 反应体系。
某个晚上，我尝试将脂质浓度从5 μM提升到 500 μM、1 mM 进行 PB 反应后再稀释到 5 μM 进行质谱分析，发现脂质基本反应完全。尽管这一条件在实际生物样本分析中难以实现，但它让我们意识到 PB 反应受脂质浓度控制。这项工作最终发表在《Analytical Chemistry》上（Anal. Chem. 2023, 95, 11, 5117.）。我的第一篇文章产出较晚，实验虽在博士三年级第一学期完成，但正式发表是在四年级寒假，受疫情影响，可视为三年级发表。与师兄师姐相比，课题进度较慢，这主要源于我的文章写作和作图能力不足。此外，这个课题在筛选PB试剂和光催化剂付出了太多时间成本，实际上应该考虑先把整条路径完成后再考虑优化。
Part2 摸索前行
2021年，完成首个课题后，2022年下半年，课题组装上了Waters公司的Cyclic IMS 仪器。由于初入课题组时，我最先接触的是TIMS TOF质谱仪，那时候就积累了离子淌度相关知识，便主动向导师请缨，担任该仪器管理员之一，并计划借此开展课题。考虑到 cyclic IMS凭借强大的淌度分辨能力，如果 PB-MS/MS结合，就可以构建精细脂质组的快速分析流程，以彰显其快速高效的分离优势。经文献调研，我们选定皮脂中的脂质作为研究目标，其富含多种中性脂质，正好适配我在首个课题中开发的带吡啶环的光催化 PB 反应体系。
由于当时缺乏该仪器的使用经验，我与Waters公司的许译升工程师一同摸索学习。幸运的是，课题组同学尚未将课题迁移至这台新仪器，我得以在周末完整实验两天。但是这也让我在非工作时间频繁向工程师请教，他们即使在家，也会耐心解答，记得通话时能听到他们孩子玩耍的声音，还有工程师表示要去徒步，下山才有信号。该课题于2022年7月启动，从优化反应条件到收齐数据，仅用4个月，远快于首个课题，我意识到前期训练的重要性。尽管仍有些焦虑，但信心有所提升。然而，因自身写作能力不足，课题完成一年后才正式发表。如今回顾，该课题的不足在于未涉及临床样本，仅停留在方法学阶段。2023年3月，我有幸参加新加坡的脂质组学会议，这是我首次参加学术会议。这次经历让我明白闭门造车的危害，收获了正向的鼓励和认可，对我当时的状态而言极为珍贵。该课题最终发表于《Analytical Chemistry》（Anal. Chem. 2024, 96, 14, 5589）。有趣的是这项工作在发表后，受到了学术圈之外的关注，我曾经受到两个邮件询问我毕业后有没有意向一起创业。此外，还有两个课题组因为关注到这项工作了解我们对于IMS的使用经验，寻找我们解决他们的分析问题。
第二个课题完成后，河南大学的Leelyn Chong副教授联系瑕老师，希望合作研究植物在环境刺激（温度）下的脂质结构变化。在瑕老师的鼓励下，我们开启了合作课题。借助 AMPP 表征脂肪酸总组成，PB-MS/MS分析脂肪酸 C=C 位置异构体，顺利发现植物在环境刺激下的精细结构响应，Leelyn团队通过转录组实验也找到了相关基因，还发现喷洒特定脂质异构体可助植物应对低温刺激。目前该课题正在投稿中。原计划我们还将开展另一个相关课题，即植物脂质精细结构方法学开发。课题组本科生于骐瑞曾初步建立植物特有甘油糖脂精细结构分析方法，但他离开课题组后，相关数据未再整理。这一课题的经历让我学会了怎么去和不同背景的研究者沟通、交流以及如何推进课题进展，我觉得这样的经验也是一个很重要的博士训练部分。
在完成第二个课题的实验部分后（2023 年上半年），我一度对第三个课题的研究方向感到迷茫。瑕老师给了我两个建议：其一是围绕极性脂质开发一个基于光催化PB反应的应用型方法；其二是深入探索 PB 反应诱导的 C=C 异构化机制。从效率和成果的角度来看，前者可能更快能出成果，但对我而言略显平淡，于是我选择了后者，并开始系统调研这个方向。这个思路的起点，源于武汉大学陈素明老师团队此前的工作。他们在《Nature Communications》上发表了一项研究，利用光催化 PB 反应同时实现脂质中 C=C 双键的位点与构型解析（Nat. Commun. 2022, 13, 2652）。在陈老师的工作中，他们通过羰基自由基催化使顺式 - C=C 向反式转化，而反式向顺式的逆转则较少发生，基于这种不对称的异构化特性，结合反向色谱的分离，实现了脂质构型的分析。然而，在我们课题组谢晓波博士在更早的研究中发现，丙酮作为光敏剂进行催化时，脂质的C=C双键（无论起始为顺式或反式）最终会达到约 1:1 的构型平衡。也就是说，不同羰基试剂会导致显著差异的异构化效率。我们的初步实验发现丙酮、二苯甲酮这类试剂会产生构型1:1的平衡，而其他羰基试剂倾向于产生反式C=C异构体。这一差异背后的机理引起了我们的兴趣，但在与清华大学化学系郭兴伟老师讨论后，我们意识到目前并没有合适的实验手段能深入探究这一自由基异构化的本质机制。后来，我们将研究的重心转向开发一种更高效、结构信息保持更完整的脂质 C=C 异构体解析策略。
基于此，我们尝试开发一种高效的 C=C 异构化方法，并与在线PB-MS/MS耦合，实现对每个色谱峰的C=C位点和构型同步解析。这一思路的启发，来自课题组此前已有的研究基础，包括使用巯基-烯烃反应对甘油二酯、固醇类脂质进行衍生化，以及用于蛋白质二硫键分析的策略。我调研发现，巯基自由基催化C=C异构化在有机化学和化学生物学中已有广泛应用。我们在文献方法基础上，经过简化和优化（将光引发剂改为3 %丙酮），成功建立了一种质谱兼容的巯基自由基催化C=C异构化方法，效率约为80%。结合在线PB-MS/MS分析，我们实现了对甘油磷脂C=C位点与构型异构体的解析，成功构建了细菌脂质的异构体定性定量分析，还发现主要的甘油磷脂的反式C=C异构体在刺激后（甲苯）均出现上调。
有趣的是，在处理数据时我们发现，含有C16:1链的脂质中，反式构型的比例显著高于C18:1链脂质。我将这一现象反馈给瑕老师，我给出的推测是可能与细菌中催化异构化的酶Cti存在脂肪酸链选择性有关。瑕老师鼓励我在这个课题中突破此前工作局限在分析方法学的开发，尝试探索其背后的生物学机制。后来，我在小红书上找到了具有蛋白组学背景的白慧娇同学（清华生科院邓海腾课题组），请她帮助我们提取、纯化和浓缩细菌周质蛋白。我们确认在甲苯刺激下，Cti 酶水平显著上调。随后，我们共同设计了同位素标记的脂肪酸喂养实验，观察不同脂肪酸在刺激下的构型转化差异，结果与我们在脂质水平观测到的构型差异高度一致。
不过，随着课题的推进，我们逐渐意识到实验设计中仍存在局限。比如使用甲苯作为刺激物，其生物学意义相对有限，若改用特定抗生素或更具生理相关性的应激条件，可能会更具解释力。这一点后来在 ASMS 2024（洛杉矶）和 ILS 2024（深圳）汇报时也得到了专家类似建议。这个课题最终成功发表在《Analytical Chemistry》（Anal. Chem. 2025, 97, 19, 10378.），对我来说不仅是我第一次尝试走出方法学的 “舒适区”，去探索一个更综合、更具生物意义的科学问题。
Part 3 渐渐上路篇
在上一课题初步数据收尾、补做后续生物实验之际，我与瑕老师开启了关于我的博士最后一个课题的探讨。瑕老师建议设计一个 PB 反应装置以增强光催化，这既延续了光催化 PB 课题的整体架构，又能让我的博士论文更为完整。值得一提的是，瑕老师打电话给我提出这个想法时，我正处于暑假休假状态，被困在因独库公路封路的雪山，手机没信号，只能借领队的手机接听，同车的六个人在看着车外的大雪和雪山，听了半小时这通他们完全听不懂的通话。
回到乌鲁木齐市里，我联系了有光学背景的精密仪器系的郭翔宇师兄，探讨了课题的可行性和设计思路，师兄总是能给我很可靠的建议。返京后，我开始调研，并向瑕老师汇报了所需资源、设计思路及初步实验方案。但坦白说，当时我心里对这个课题兴趣不足，瑕老师也察觉到了。彼时，我关注到脂质定量技术的发展较为滞后，相关方法稀缺。一个傍晚，在澜园吃饭时，我突然冒出一个 idea，虽和实验室同学分享后他和我可能都有些懵，但通过讲述，我理清了思路。后续完善后，我与瑕老师深入论证，她在办公室的白板上和我一起反复推敲，还提出了另一种思路。我还记得那天我们两个人很开心地在她的办公室的黑板写写画画，讨论了一个半小时。这个课题让我有相对的独立性，很深刻得品尝到了科研的快乐。未曾想，一年多过去，这个课题进展未达预期，目前只是初步论证了整条道路，但是仍在优化生物样本衍生化条件。具体细节暂且不表，只愿不久后能顺利发表。
(a) ILS11会议现场（@新加坡）；(b) 2024 ASMS 期间 Scott A. Mcluckey 师门合影（@洛杉矶）；(c) 2024 ASMS 海报交流现场；(d) ILS 2024 会议海报交流现场（@深圳）；(e) ILS 2024 会议志愿者服务瞬间；(f) ILS 2024 部分志愿者与韩贤林教授合影。
回首来时：沉淀成长体悟
写到这里，才发觉不知不觉已经说了很多。其实我不觉得自己是一个优秀的博士生，如果要说点值得自豪的事，大概是博士生涯的最后一年多，我终于有了一些属于自己的想法，而导师也愿意支持我，我们一起把这个想法慢慢落地。
我更想谈的，是那些不太被写进论文里的时刻。比如，如何在长时间的课题无进展中对抗情绪的低谷。我直到博士第四年才发了第一篇文章，是慢了些。但也正是在那之后，研究渐渐有了自己的节奏。我想，屏幕前或许也有和我一样的朋友。那些在深夜看着糟糕数据无语的时刻，那些凌晨两点实验又失败、甚至不小心打翻试剂的狼狈，那些为了仪器资源，不得不把生活节奏倒过来——下午睡一觉，然后从黄昏一直忙到天亮。真正让我咬牙坚持下来的，其实就是正向的数据，只有咬咬牙收到好的数据终于让我松口气。但是，其实我到博士高年级才意识到，收到坏数据并不可怕，但是要争取每次实验可以有个结论，最可怕的是做了实验，但是无法帮助你做有效判断。此外，实验室之外的世界也变得格外重要。我会去北京的山野徒步、节假日一个人远走、或者窝在宿舍看美剧日剧韩综，吃上一口夏日的西瓜；还有家人朋友的陪伴——这些都是我的 “非科研生活”。我办了一张北京的旅游年票，不开心的时候就进颐和园，在长廊尽头的石凳上坐一下午，看昆明湖泛光，看人来人往。有时候，什么也不做，就这么静静坐着就很治愈我。
给屏幕面前的低年级博士生同学分享一些我自己的反思：
课题早期，别困在细节里，先打通全流程，很多细节后期会迎刃而解。
广泛涉猎不同方向文献，灵感常藏于跨界知识融合处。
遇到自身难以解决的难题，比如我的课题中的生物或光学的调试等超出能力范围了，可充分寻求各种资源帮助，在我的课题中，给出建议或者参与我的课题的包括美国、新加坡、深圳、北京、兰州的朋友。当然，别人求助时，我们也要尽力相助。
懂得正确借助导师力量。导师是 gatekeeper，但是我们自己才是解决问题的第一责任人。
博士学位论文答辩后，和瑕瑜老师的合影。
在科研的漫漫征途中，我们都在不断探索、成长，愿我们都能在挑战中找到属于自己的科研节奏，收获属于自己的成长与成就。最后，在这里感谢瑕老师，Xia Lab所有成员，合作者以及这条路上遇到的所有朋友。
