RAW 264.7细胞总脂肪酸C=C位置异构体的深度分析揭示去饱和途径的多样性

近期，清华大学化学系瑕瑜教授课题组与清华大学药学院尹航教授课题组合作在Journal of Lipid Research杂志上发表了题为 “Alternative fatty acid desaturation pathways revealed by deep profiling of total fatty acids in RAW 264.7 cell line” 的文章。论文第一作者为清华大学化学系2018级博士生夏天，通讯作者为瑕瑜教授。

在该研究中，作者采用2-乙酰吡啶（2-Acetylpyridine，2-acpy） Paternò−Büchi（PB）衍生化技术对RAW 264.7巨噬细胞总脂肪酸的不饱和位点进行了深入分析（图1），发现RAW细胞中有许多不常见的脂肪酸C=C位置异构体，随后作者使用去饱和酶抑制剂干扰细胞，并追踪这些不寻常脂肪酸C=C位置异构体的组成变化。研究结果表明SCD1 Δ9-去饱和酶和FADS2 Δ6-去饱和酶在生成这些不寻常脂肪酸C=C位置异构体中起到关键作用。

图1 RAW 264.7巨噬细胞总脂肪酸的深度分析工作流程。

RAW细胞表达多种涉及脂质代谢的去饱和酶，因此是用来研究脂质代谢的常见细胞模型。目前关于奇数链单不饱和脂肪酸（Monounsaturated Fatty Acid, MUFA）及其不饱和位置的研究还比较有限，作者重点关注对奇数链MUFA进行分析。图2显示了FA 17:1的2-acpy PB-MS/MS谱图。通过检测C=C诊断离子（n-xfo和n-xFo，用结构如图1所示），作者准确鉴定FA 17:1 有6个C=C位置异构体（图2）。

图2  2-acpy衍生化后FA 17:1的MS2 CID谱图。插图中显示了6个检测到的FA 17:1 C=C位置异构体的结构及其碎裂图谱。

研究发现奇数链MUFA中的n-6、n-8和n-10异构体源自于SCD-1酶对FA 15:0、FA 17:0和FA 19:0进行Δ9去饱和，因此当抑制SCD-1酶时，奇数链MUFA中n-6、n-8和n-10异构体的含量会降低。此外，研究还发现FADS2可以对FA 17:0进行Δ6去饱和，产生n-11奇数链MUFA。当抑制FADS2时，奇数链MUFA中n-11异构体的含量也会降低。图3总结了在RAW细胞中观察到的奇数链MUFAs的生物合成通路。

图3  RAW细胞系中观察到的奇数链单不饱和脂肪酸的生物合成通路。E：延长；β-ox.：β-氧化。

研究还发现，SCD-1对FA 14:0、FA 16:0和FA 18:0的Δ9-去饱和作用生成了偶数链MUFA的n-5、n-7和n-9异构体。FADS2可以对FA 16:0和FA 18:0进行Δ6-去饱和作用，使得偶数链MUFA中产生n-10或n-12异构体。研究还发现FADS1可以对FA 18:0进行Δ5-去饱和作用，进而生成FA 18:1(n-13)，抑制SCD1或FADS2后，由于SCD1或FADS2对底物FA 18:0竞争减少，所以FA 18:1(n-13)异构体增加。

除了MUFA异构体多样化外，RAW 264.7细胞内多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）的从头合成比以往报道（n-3和n-6途径）的要复杂得多。研究发现偶数链MUFA是可以作为去饱和酶的底物，进而产生多种PUFA异构体，包括n-7、n-9、n-10和n-12异构体。其中FADS2和SCD1均参与PUFA中n-7和n-9异构体的形成，抑制FADS2或SCD1会降低PUFA中n-7、n-9异构体的相对含量。FADS2和FADS1还参与PUFA中n-10和n-12异构体的形成，抑制FADS2会导致PUFA中的n-10和n-12异构体的相对含量降低。研究还发现当PUFA中n-7、n-9、n-10和n-12异构体的从头合成通路被阻断时，RAW264.7细胞倾向于从培养基中摄取PUFA的n-3和n-6异构体。图4总结了在RAW细胞中观察到的PUFA的生物合成通路。

图4  RAW细胞系中观察到的多不饱和脂肪酸的生物合成通路。E：延长；β-ox.：β-氧化。

值得一提的是，作者还在RAW 264.7巨噬细胞中观察到非亚甲基间断FA，即FA 24:2(n-9, n-15)（图 5）。FA 24:2(n-9, n-15)的结构可通过m-CPBA环氧化和RPLC-MS2 CID得到了进一步验证（图 5）。非甲基间断脂肪酸常在软体动物中发现，可以占到软体动物总脂肪酸的20％，却在哺乳动物中很少报道。目前关于这些非甲基间断脂肪酸的从头合成通路及其明确的生物功能尚不清楚。

图5  RAW 264.7细胞中（a）2-acpy PB衍生的FA 24:2和（b）FA 24:2的环氧化产物的MS2 CID谱图。

综上所述，该研究重点探索了RAW 264.7细胞脂质组中FA C=C位置异构体，揭示了细胞脂肪酸去饱和度的复杂性和动态性。基于实验观察，提出了奇数碳链MUFAs、偶数碳链MUFAs和PUFAs的生物合成途径。虽然需要进一步的研究来详细阐明这些不寻常的不饱和脂肪酸在细胞生物学中的功能和作用机制，但该实验工作流程和发现为未来的探索提供了一个重要的指引。

最后感谢国家自然科学基金委（No. 22225404）、国家科技部重点研发计划（2018YFA0800903）提供的经费支持。

本文编辑：夏天

本文审核：瑕瑜  简瑞君

本文链接：https://doi.org/10.1016/j.jlr.2023.100410